质谱π谈 | 一文读懂流动相中的醋酸铵，告别实验踩坑

醋酸铵缓冲液在实验室中可能存在多种问题。其中两个常见问题：

1.仪器过夜停机后再次启动时，色谱压力出现意外升高

2.质谱灵敏度难以保证

在分析中，使用醋酸铵（及甲酸铵）时仪器压力增高是常见问题，尤其当仪器停机过夜或每日首次运行时，在实际应用中出现严重的问题，例如毛细管、预柱及分析柱末端过滤片堵塞。

这些问题往往源于对缓冲液溶解度的误解。

图1. 五种缓冲液与乙腈混合物的溶解度

图1清晰表明：在含90%以上乙腈的二元混合溶剂中，醋酸铵的溶解度逐渐降低，且在100%乙腈中完全不溶。

在90%乙腈中，醋酸铵的溶解度上限为20mmol/L；而当乙腈浓度升至95%时，该上限值骤降至10mmol/L（该浓度常用于液相色谱-质谱联用技术的缓冲液）。

超过这些溶解度上限会导致溶液中形成细微醋酸铵沉淀，形成浑浊液体。这可能会堵塞毛细管和色谱柱滤片，导致系统压力升高。

还需注意图1数据采用高品质缓冲液测得——若使用纯度较低的缓冲盐试剂，溶解度将进一步降低。即使后续可向溶液中加水，也应避免尝试将醋酸铵溶解于纯乙腈中。尽管初始观察可能显示缓冲液可溶，但其将迅速析出（见图2）。

图2. 将醋酸铵溶解于乙腈后，再加入水以达到洗脱剂所需的有机相比例时，容器中形成的醋酸铵沉淀

在典型的反相HPLC梯度洗脱中，这或许并非大问题——除非梯度流动相中乙腈浓度超过90%。

然而，在使用醋酸铵缓冲液时，我们还需考虑其他因素，即当缓冲液与有机溶剂混合时，其相对比例可能发生剧烈变化，导致醋酸铵因溶解度骤降而析出结晶。这种风险在以下几种情况下尤为突出：

1.在低压或高压混合系统中配制流动相时：如果比例设置不当，可能在混合瞬间就产生结晶。

2.注入溶解于高浓度乙腈的样品时：样品进入系统会造成局部有机相浓度瞬间过高，引发局部结晶。

3.最危险的情况：当为了冲洗色谱柱污染物或进行过夜保存，而用100%的乙腈冲洗整个系统时，系统中残留的缓冲液会与纯乙腈混合，在此过渡阶段会形成高有机相环境，从而引发醋酸铵大规模结晶，这极易堵塞甚至损坏昂贵的色谱系统组件。

醋酸铵作为缓冲剂

许多人选择使用醋酸铵作为缓冲剂，尤其在质谱检测时，因其具有固有的挥发性且不易污染活性药物成分源。但需注意其溶解度有限，应据此调整高效液相色谱操作。需明确醋酸铵是否适用于实验，以及缓冲剂是否确有必要。

人们常对缓冲剂的使用要求、适宜选择及浓度存在误解。醋酸铵正是探讨这种广受欢迎的缓冲体系正确与误用场景的典型案例。

缓冲液的作用在于抵御pH值（主要指流动相）的微小波动，并确保HPLC色谱柱保持恒定电荷状态（主要指硅胶载体表面残留硅醇离子的电离状态）。pH值变化可能导致保留时间不稳定、峰形异常，以及（使用电喷雾质谱时）仪器灵敏度下降。

通常，系统pH值面临的最大"挑战"源于进样器与HPLC色谱柱（或预柱）之间的连接组件，以及色谱柱顶部区域，样品稀释液与流动相在此处混合。若样品稀释液pH值不同，则分析物（或部分分析物分子）可能改变电离状态，从而导致色谱行为或质谱接口响应发生变化。因此，理解分析方法的化学原理以关键性选择缓冲液类型和浓度至关重要。由于待测物浓度较低且需pH控制的色谱柱表面积有限，仅需极低浓度的缓冲液即可维持可重复的保留时间、可接受的峰形及检测灵敏度。

图3显示了醋酸铵在色谱分析和质谱分析中均可发挥作用的情形。

图3. 不同乙腈比例（%）下醋酸铵水溶液（10mmol/L）的缓冲容量变化

本质上，当向流动相中添加10mmol/L 醋酸铵时，存在两个缓冲区域，此时需使用稀氨水或甲酸调节pH值。若不添加酸或碱，溶液的缓冲能力将非常有限。

在100%水溶液中，缓冲剂的pKa值约为4.8和9.5。该缓冲体系最适宜在pKa值±1个pH单位范围内使用，此时缓冲能力可维持在约66%。当偏离pKa值达2个pH单位时，缓冲能力将降至约5%。

对于水中的醋酸铵缓冲液，当使用甲酸调节pH值时，分离流动相pH值应为3.8至5.8；若用氨水调节流动相pH值，则应为8.5至10.5。

需注意：当乙腈加入系统后，该工作范围将发生变化，在60%乙腈浓度下可用pH范围变为5.2至7.2或7.9至9.9。梯度分离过程中，缓冲系统的pKa值将持续变化。系统初始梯度组分下的pKa值可用于评估该缓冲液在分离中的适用性。

这些pH范围能否避免分析物电离程度或色谱柱质子化程度的变化？这是关键问题。

对于质谱检测，电离态的离子性分析物可获得良好检测灵敏度，同时通过合理选择固定相及有机溶剂类型与组成来控制反相保留。若分析物在上述pH范围（及图3所示范围）内完全电离，则可获得良好的色谱分离与检测性能。

需注意图1显示：随着乙腈添加量增加，系统的缓冲容量逐渐降低，当乙腈浓度达60%时，缓冲容量仅为水相值的30%。LC-MS中使用缓冲液的核心原则是：以最低用量维持保留时间重现性、峰形质量及检测灵敏度。缓冲液浓度直接影响离子抑制程度，进而直接影响方法灵敏度。为在较低缓冲浓度下保持良好缓冲能力，我们通常将缓冲液pKa值控制在±0.5单位范围内。

表1.醋酸铵缓冲液在其中具有实用价值的推荐pH范围

使用表1中的缓冲范围选择流动相pH值，确保分析物在此pH值下实现100%电离。需注意，推导这些数值时采用的缓冲液浓度为0.1mM——这是质谱检测中常用的缓冲浓度选择。对于碱性分析物，乙酸/醋酸盐缓冲体系较为常见，且流动相pH值通常远低于碱性分析物的pKa值，以确保其持续质子化。对于酸性分析物，采用铵盐/氨水体系时同样适用此原则，此时所有酸性分析物均应完全去质子化。这将确保保留时间稳定、峰形良好，并从方法化学角度优化质谱灵敏度。

基于醋酸铵的流动相存在显著的有效缓冲范围缺口。具体而言，当流动相中乙腈含量为20%（或起始梯度浓度为20%乙腈）时，若流动相pH值低于4.2、介于5.2至9.0之间或高于10.0，其缓冲能力可能较弱（需使用更高浓度的缓冲液）。

其他方法在使用醋酸铵缓冲液时，流动相pH值可能调整至推荐范围之外。建议考虑采用不同缓冲体系——甲酸盐/甲酸体系是流动相pH值低于4.2时的常用选择。

是否应始终使用缓冲液？

若流动相pH值远离待测物的pKa值，流动相pH值的微小变化对待测物电离程度的影响可忽略不计。在此情况下，使用缓冲液可能并非必要。例如，乙酸（以及甲酸、三氟乙酸和二氟乙酸）在低pH值下具有显著的"自缓冲"能力，可使碱性分析物的pKa值提高2个pH单位以上，同时使酸性分析物的pKa值降低。

以上假设均基于：碱性分析物采用酸性流动相系统分析，酸性分析物则采用pH值更偏碱性的流动相系统，以确保完全电离及良好的电喷雾质谱灵敏度。若遇到仪器压力问题、保留时间不稳定或质谱检测灵敏度不足，则值得重新评估是否需要缓冲盐。合理使用甲酸、乙酸或氨水溶液往往能解决相关问题。

无论何种情况，都需深入理解方法的化学原理：分析物pKa值、所需流动相pH值，以及为维持系统内该pH值而选用的缓冲体系。

对于缺乏分析物pKa数据的情况，有多款免费程序可基于结构合理预测pKa值。本实验室常用工具包括：

ChemSketch-https://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch/

MarvinSketch-https://chemaxon.com/products/marvin